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让膜蛋白结晶触手可及
您是第位阅读本文  发布时间:2016-9-19 15:09:52

    完整的膜蛋白如G蛋白偶联受体(GPCR)和离子通道,是参与细胞信号通路、细胞稳态和人类疾病的关键分子;大约三分之一已批准的药物靶定了这些蛋白。因此,获得膜蛋白的高分辨率结构信息,以便与分子和细胞数据互补,对科学界和药物开发行业相当重要。

    众所周知,膜蛋白很难纯化和结晶,因为它们在天然脂双层之外的环境中不稳定,容易沉淀。正因为如此,使用水溶液的结晶学传统方法不适合它们的重新溶解。在1996年,科研人员开发出一种in meso脂立方相(LCP)技术,实现了细菌视紫红质的结晶1,从那以后也彻底改变了膜蛋白的结晶过程。这种方法为膜蛋白的成核和生长提供了一个框架,从而促进了结晶。

    LCP结晶是通过两个步骤开展的。首先,蛋白与脂类混合,自发形成脂立方相,产生了果冻状的高粘稠物质。为了加强结晶,还添加了添加剂和沉淀物,取决于不同条件,结晶一般在数日或数周出现。

    结晶试验通常包括在样品上试验的大量条件。高效的结晶试验不仅需要尽可能降低样品体积,以确保宝贵蛋白的最大限度利用,还需要自动化开展,以便减少艰苦的体力劳动并加速平板制备过程。自动化减少了手动移液的误差,并确保了样品均一性。
 
    目前与LCP方法相关的多个技术问题为此过程的自动化带来了挑战。然而,主要问题在于很难准确处理小体积且极为粘稠的立方相材料,直到最近,这一问题才成功解决。

脂类/蛋白相的混合和处理
  
    蛋白和脂类的混合问题是由Martin Caffrey成功解决的,这位科学家目前在都柏林的圣三一学院,他开发出一种方法来连接两个注射器,一个含有脂类,而另一个含有蛋白,这两个注射器由体积连接器相连。注射器之间蛋白和脂类的来回反复混合使得脂立方中间相形成2。

   mosquito® LCP移液设备旨在将LCP材料和筛选缓冲液的纳升级分液过程自动化。它是通过TTP LabTech、Gebhard Schertler和Pat Edwards之间的合作项目而开发的。

    通过一个可选的LCP混合器,mosquito® LCP为in meso(LCP)技术提供了一个全自动的方案,从而显著提高了设置筛选平板的速度。准确分配纳升级LCP溶液的能力,其体积比手动方法要小得多,节省了宝贵的样品,实现了更多筛选条件的评估。

LCP分液准确性和重复性

    mosquito® LCP的可靠性是基于其注射器分液臂和mosquito移液器吸头准确分配LCP液滴和筛选溶液的能力,确保了液滴体积和位置的一致,从而避免了手动误差。

    mosquito® LCP融合了已被广泛接受的mosquito® Crystal的特征和功能,将mosquito移液头与微注射器分液器相结合,能将25-2000 nl的LCP材料准确分配至载玻片或市售的平板上。mosquito® LCP与所有SBS形式的平板兼容,包括最近由Schertler小组和SWISSCI开发的LCP平板,它能实现晶体的高效成像。

   mosquito® LCP分配体积的分析证明了它的高准确性,对于低至25 nl的体积,误差小于10%。图1表明,对于所有检测的体积,液滴体积的变异系数(CV)百分比小于10%,且随体积增加而逐渐降低。

    每孔中液滴的精确和重复定位(在5 μm之内)确保了LCP液滴顶部的准确缓冲液覆盖以及膜蛋白晶体的高效成像(图2)。一旦分配了LCP液滴(图2a),会迅速地将沉淀剂直接加在这些液滴上,让它们暴露在空气和环境影响中的时间缩短至2秒以内(图2b)。

图1 | mosquito® LCP注射器的分液准确性变化小于10%。在膜蛋白结晶常用的100 μl体积,其准确性提高至6%。

图2 | 利用TTP LabTech的mosquito® LCP精确且重复地放置每孔中的液滴。(a) 正向置换注射器泵将50 nl LCP液滴分配至96孔板中,且在5 μm之内。(b) 利用mosquito一次性吸头将纳升级的沉淀剂以列形式快速分配至LCP液滴上,从而减少了LCP液滴在空气和环境影响中的暴露。

沉淀和结晶

    在优化结晶过程的筛选阶段,一个准确的自动化移液系统的真正好处变得明显。在此阶段要研究各种添加剂(如去垢剂、有机物、盐)和市售的沉淀剂,以确定晶体形成的最佳条件。

    mosquito Crystal、mosquito® LCP臂和移液头的组合实现了全自动的LCP液滴、添加剂和沉淀剂分配,让96孔板的设置可在5分钟内完成,且独特的正向置换吸头允许多次吸取和沉淀剂添加。一次性吸头保证了零交叉污染,避免了耗时的吸头洗涤。

    让整个过程自动化不仅节省了时间和精力,也确保了分配的液体体积和液滴位置的重复性,这对膜蛋白的高效结晶很关键。图3显示了最近利用TTP LabTech的mosquito® LCP对β-肾上腺素受体的成功结晶,从而实现了这种膜蛋白的高分辨率结构确定。

图3 | 利用TTP LabTech的mosquito® LCP对β-肾上腺素受体的结晶。(a) LCP设置中的β-肾上腺素受体是在LCP夹心板中以280 nm波长的光成像的。(b) LCP晶体中的β-肾上腺素受体层与膜平面大致垂直。(图片是由T. Warne、P. Edwards和G. Schertler提供的。)

    就所有蛋白的结晶学而言,环境(温度和湿度)对洁净过程的影响至关重要。对于高度敏感的膜蛋白更是如此。TTP LabTech的mosquito® LCP仪器的小巧和稳定不仅确保了它的占地面积很少,还让科学家能够将其转移至环境可控的空间,便于膜蛋白的成功结晶。

1. Landau, E.M. & Rosenbusch, J.P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14532–14535 (1996).生物通 www.ebiotrade.com
2. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H. & Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids 95, 11–21 (1998).


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